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白蛋白與白蛋白融合蛋白的親和層析純化

人血清白蛋白

人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì),占血漿蛋白的40-60%,半衰期長(zhǎng)達(dá)20,具有重要的生理學(xué)和藥理學(xué)功能,能維持血液正常的滲透壓,穩(wěn)定電解質(zhì)和酸堿平衡,參與物質(zhì)運(yùn)輸。臨床上,人血清白蛋白一直被譽(yù)為“黃金救命藥”,主要用于手術(shù)輸血和危重病人的補(bǔ)液、治療創(chuàng)傷或燒傷引起的休克、治療低白蛋白血癥等。

人血白蛋白(圖片來源于網(wǎng)絡(luò))

人血清白蛋白在臨床上使用量很大,通常每劑量高達(dá)10g。而市售的治療性人血白蛋白多數(shù)來源于血漿,經(jīng)冷乙醇沉淀、柱層析、過濾等多種技術(shù)結(jié)合的方式純化獲得。由于人血漿來源有限、動(dòng)物源性污染風(fēng)險(xiǎn)高,近年來,全球范圍內(nèi)很多公司和實(shí)驗(yàn)室都在嘗試采用基因工程的手段來制備重組人血清白蛋白(Recombinant Human Serum Albumin,rHSA),2024年4月8日,通化安睿特生物制藥股份有限公司自主研發(fā)的重組人白蛋白注射液,完成在俄羅斯的注冊(cè),成功獲得歐亞經(jīng)濟(jì)聯(lián)盟-俄羅斯聯(lián)邦衛(wèi)生部批準(zhǔn)上市,成為全球首個(gè)獲批上市的治療性重組人血清白蛋白產(chǎn)品,極大推動(dòng)了全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

人血清白蛋白由585個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,無糖基化,分子量約66kDa,親水性較高,分子中包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域(Domains)和35個(gè)半胱氨酸殘基,組成17對(duì)分子內(nèi)二硫鍵和一個(gè)游離的半胱氨酸殘基,確保了其結(jié)構(gòu)域的剛性特點(diǎn)。

Mimetic Blue® SA HL P6XL層析填料

Mimetic Blue® SA HL P6XLAstrea Bioseparations公司推出的白蛋白親和層析填料填料基架是粒徑均一的交聯(lián)瓊脂糖,配基是合成的蒽醌化合物可以特異性結(jié)合白蛋白,用于血漿來源的白蛋白重組白蛋白的捕獲。Mimetic Blue® SA HL P6XL的性能參數(shù)如下表所示

Mimetic Blue® SA HL P6XL親和層析填料具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性,如圖1所示,將填料浸泡于不同pH的試劑中,測(cè)試3個(gè)月,在pH 3-13的范圍內(nèi),填料無明顯配基脫落,結(jié)合效果良好,除此之外,Mimetic Blue® SA HL P6XL親和層析填料常見的變性劑如尿素和鹽酸胍、表面活性劑、還原劑等兼容良好。基于其良好的化學(xué)穩(wěn)定性,Mimetic Blue® SA HL P6XL親和層析填料可高效重復(fù)使用,在超過100個(gè)批次(>100 cycles)重復(fù)使用后,仍保持卓越的結(jié)合載量和純化效果。

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1. Mimetic Blue® SA HL P6XL的pH耐受性測(cè)試

在一項(xiàng)測(cè)試中,研究人員將未經(jīng)處理的人源性血清直接上樣到裝有Mimetic Blue® SA HL P6XL填料的層析柱中,層析工藝參數(shù)如下表所示:

由圖2的層析圖譜和圖3的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果可以看出,Mimetic Blue® SA HL P6XL可以選擇性的結(jié)合血清中的白蛋白,其他蛋白隨流穿液離開層析柱,洗脫液中白蛋白純度高達(dá)96%,回收率高于90%。

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圖2. Mimetic Blue® SA HL P6XL捕獲血漿來源白蛋白的層析圖譜

 

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圖3. SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Lane 1: molecular weight marker; Lane 2: load; Lane 3: flow through; Lane 4: elution

Mimetic Blue® SA HL P6XL訂購(gòu)信息

散裝填料

預(yù)裝柱



白蛋白融合蛋白


白蛋白融合蛋白示意圖(圖片來源網(wǎng)絡(luò))


白蛋白融合蛋白(rHSA Fusion Proteins)是將目的蛋白與白蛋白進(jìn)行融合表達(dá)的蛋白質(zhì),可延長(zhǎng)目的蛋白在體內(nèi)的半衰期,在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。早在1992年,歐洲科學(xué)家就嘗試將白蛋白和CD4蛋白基因融合后在酵母體系中表達(dá),用于HIV的治療。2014年,GSK公司推出一種GLP-1受體激動(dòng)劑阿必魯肽Albiglutide),用于治療2型糖尿病,該藥物是將兩個(gè)GLP-1串聯(lián)后與rHSA融合,具有長(zhǎng)效性,僅需每1-2周注射一次,可有效幫助患者管理其血糖水平。2016年,CSL Bering公司Idelvion經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市,該產(chǎn)品是凝血因子IX和rHSA的融合蛋白,在血液中半衰期更長(zhǎng),用于治療B型血友病。此外,還有很多其他類型的白蛋白融合蛋白正處于臨床試驗(yàn)階段,例如,生長(zhǎng)因子-rHSA融合蛋白、白介素2-rHSA融合蛋白、抗體片段-rHSA融合蛋白(如scFv-rHSA融合蛋白)、干擾素α-2b-rHSA融合蛋白等。

AlbuPure®層析填料

AlbuPure®是Astrea Bioseparations和Albumedix公司合作開發(fā)的白蛋白親和層析填料,填料基架是粒徑均一的高交聯(lián)瓊脂糖,配基是合成的三嗪化合物,具體高流速、高動(dòng)態(tài)結(jié)合載量、強(qiáng)化學(xué)耐受性等特點(diǎn),主要用于白蛋白融合蛋白的純化。AlbuPure®的性能參數(shù)如下表所示

AlbuPure®具有卓越的白蛋白融合蛋白結(jié)合性能,如圖4所示,研究員在不同pH值不同流速的上樣條件下,探究了AlbuPure®對(duì)scFv-rHSA的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量,結(jié)果表明,在pH=4.5,240cm/h線性流速下,AlbuPure®對(duì)目標(biāo)融合蛋白的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量最佳,10%流穿時(shí),載量高達(dá)38.4mg/mL。

圖4. AlbuPure®動(dòng)態(tài)結(jié)合載量研究

Mimetic Blue® SA HL P6XL類似,AlbuPure®親和層析填料也具有優(yōu)秀的化學(xué)穩(wěn)定性可耐受1M NaOH溶液的清潔,對(duì)常見的變性劑、表面活性劑、還原劑等兼容性良好。

一項(xiàng)研究測(cè)試中,研究員使用酵母體系表達(dá)Anti-HIV gp41-rHSA融合蛋白(72kDa),收獲液經(jīng)澄清后,上樣到裝有AlbuPure®的層析柱中,層析工藝參數(shù)如下表所示:

由圖5的層析圖譜和圖6的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果可知,AlbuPure®可以高效捕獲Anti-HIV gp41-rHSA融合蛋白,雜質(zhì)蛋白在上樣時(shí)流穿,經(jīng)過三次不同pH值下的淋洗步驟,可進(jìn)一步去除少量掛柱的雜質(zhì)蛋白,目標(biāo)融合蛋白最后由辛酸鈉洗脫下柱,純度極高。

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圖5. AlbuPure®純化Anti-HIV gp41-rHSA融合蛋白的層析圖譜

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圖6. SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

Lane: 1. Load (diluted); Lane 2: FT (neat); Lane 3: post load wash (neat); Lane 4: wash 1 (neat); Lane 5: wash 2 (neat); Lane 6: wash 3 (neat); Lane 7: elution (diluted); Lane 8: elution (10 fold dilution of lane 7); Lane 9: human albumin standard (1μg)

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如您對(duì)上述產(chǎn)品感興趣,歡迎點(diǎn)擊這里填寫信息,Astrea Bioseparations技術(shù)專家將為您提供個(gè)性化優(yōu)化方案,切實(shí)幫您解決純化工藝中的疑難問題。

 

Astrea Bioseparations1987年孵化自劍橋大學(xué),擁有超過30年層析介質(zhì)研發(fā)和生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn),是世界級(jí)層析介質(zhì)產(chǎn)品與服務(wù)供應(yīng)商。目前使用Astrea的產(chǎn)品已有超過21個(gè)生產(chǎn)工藝通過了FDAEMA的批準(zhǔn)。Astrea Bioseparations在全球擁有3個(gè)研發(fā)和生產(chǎn)基地,專注為生物大分子和CGT領(lǐng)域提供行業(yè)領(lǐng)先的層析介質(zhì)和技術(shù)服務(wù)。Astrea Bioseparations推出的基于納米纖維的新型層析技術(shù),解決了傳統(tǒng)生物分離工具載量低和工藝耗時(shí)問題,實(shí)現(xiàn)更快、更環(huán)保、更具成本效益的純化過程,完全符合當(dāng)今生物治療創(chuàng)新的需求。

 

西美杰是Astrea Bioseparations中國(guó)區(qū)代理,為用戶提供完善的技術(shù)支持與售后服務(wù)。歡迎隨時(shí)撥打西美杰客服熱線400-050-4006或登錄網(wǎng)站m.glssly.com.cn了解更多信息。

參考文獻(xiàn)

1. 血清白蛋白的生物學(xué)特性研究進(jìn)展,生命科學(xué),第25卷,第10期,2013年10月

2.人血清白蛋白純化技術(shù)研究進(jìn)展,生物工程學(xué)報(bào),18卷6期,2002年11月

3. 人血清白蛋白融合技術(shù)在藥物長(zhǎng)效化改造中的應(yīng)用,生命科學(xué),第27卷,第9期,2015年9月

4. R. Raoufinia et al., Overview of Albumin and Its Purification Methods, 2016

5. M. Sanches et al., AlbuCORE: an albumin-based molecular scaffold for multivalent biologics design, 2020

6. Technical User Guide:  Mimetic Blue® SA HL P6XL, Astrea Bioseparations

7. Application Note: Capture and purification of human serum albumin from human source plasma using Mimetic Blue® SA HL P6XL, Astrea Bioseparations

8. Technical User Guide: AlbuPure®, Astrea Bioseparations

9. Technical Note: Capture and purification of recombinant albumin-fusion proteins using AlbuPure®, Astrea Bioseparations

 

 

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